작년쯤에 학위 논문을 위한 연구를 접기 전에 마지막으로 시도해볼까 싶었던 CRIPSR-Cas9. 2015년에는 점점 더 활발한 연구가 이루어져 왔고, 획기적인 부분으로 여겨지고 있다. 이전 실험에서 시도해볼까 말까 고민하다가, 결국 이용하지 않기로 하고 연구를 접었다. 그 때 공부를 한다고 했지만, 개념 정리가 조금 잘 안되었는데, 세미나를 들으면서 개념을 좀 더 잘 잡을 수 있었다. 노가다 시간을 상당히 줄여주지만, 그래도 줄일 수 없는 부분도 있는 듯함.
강의에서 들은 부분을 간단하게 요약하면
Cas9 단백질은 DNA 에 반복적으로 붙었다가 떨어지데, 그 중에서 PAM sequence (GG가 있는)에 결합하여 그 주위의 DNA가 double bond 가 약해지고 열려지게 되어 있음. single guide RNA (sgRNA)가 Cas9 단백질에 결합하면서 (이게 먼저인지 나중에 결합하는지는 모르겠음) 5′ 끝에서 20nt 떨어진 부분부터 5′ 끝까지 하나씩 붙어감. DNA가 거의 perfect match 가 되면 Cas9 의 nuclease domain 이 활성화되면서 DNA가 절단됨.
이 때, NHEJ 와 HR 방법을 이용해서 복원이 이루어짐. 대부분의 진핵 세포에서는 대부분 NHEJ 방법으로 DNA 손상이 수복됨. 즉, 바로 붙여버리는 것임. 원래와 똑같이 붙을 수도 있지만, 일부 DNA가 떨어져 나가면서 복원될 수도 있음. 이 과정이 지속적으로 일어나기 때문에 정상으로 남기보다 비정상적인 부분으로 남을 확률이 커짐. HR 방법은 DNA가 가지고 있는 다른 allele 의 정보를 참고로 하여 (template) 손상된 부위를 복원하는 방법임. 특정 DNA를 넣고 빼기 위해서는 이 방법을 이용해야 하는데, 원래의 정상 template DNA 가 아닌 의도하는 template DNA 가닥을 넣어줌으로써 의도한대로 DNA가 수복되게 하는 것임. HR의 효율이 높이는 것이 하나의 숙제임.
NHEJ 방법으로 deletion 을 유도하더라도 안된 세포들도 있을 수 있기 때문에 extreme dilution 을 한 후 세포를 키워가면서 DNA에 충분한 변화가 왔는지를 확인해 봐야함. 이 부분이 손이 많이 가는 부분이라고 할 수 있음. 해당 DNA 결실을 PCR로 잡아내기 위해서는 충분한 간격을 (대충 100~200bp) 두고 2종류의 sgRNA를 사용하여 deletion 을 유도하면 PCR 로도 충분히 확인할 수 있을 정도의 deletion 을 확인할 수 있음.
Off-target event는 거의 없다고 생각해도 됨. 현재까지는 0.1~0.01% 정도로 생기는 것으로 알려져 있음. Cas9 과 관련된 제품을 파는 회사에서는 이 Specifity를 높이는 것이 하나의 기술이라고 할 수 있음. Off-target event를 최소화 하는 방법으로는 Cas9 단백질와 sgRNA를 여러 vector 나 방법을 이용하여 세포의 DNA로 넣게 하는 방법보다는 sgRNA와 Cas9 단백질을 직접 많이 넣어줌으로써 초기에 확실하게 변화를 유도하는 방법이 좋음.
